Klonowanie koni – fikcja czy rzeczywistość?

Tekst: M. Orsztynowicz, M. Jankowska, M. Lach, A. Leszczyńska, I. Sobieraj i D. Lechniak
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierząt
Foto: Maciej Orsztynowicz

Zapraszamy Państwa do lektury dwóch artykułów poświęconych nowoczesnym biotechnikom w rozrodzie konia domowego, ze szczególnym uwzględnieniem klonowania dorosłych zwierząt. W niniejszym artykule, stanowiącym pierwszą cześć, przedstawimy wybrane zagadnienia z historii biotechnologii rozrodu konia, a w szczególności klonowania tego gatunku. W przystępny sposób przybliżymy procedury uzyskiwania zarodków w laboratorium (in vitro) oraz specyfikę klonowania. W drugiej części przedstawimy problemy, jakie towarzyszyły wzrostowi i rozwojowi urodzonych dotychczas klonów koni oraz historię najsłynniejszych z nich. Mamy nadzieje, że lektura naszych artykułów pozwoli Państwu na wyrobienie własnej opinii na temat możliwości uzyskiwania klonów koni oraz związanych z tym kosztów i problemów.

Biotechniki w rozrodzie koni

Przełomowe znaczenie dla rozwoju biotechnik rozrodu koni miało rozpowszechnienie sztucznego unasienniania klaczy i obrotu nasienia. Zabieg ten ma wiele zalet w hodowli zwierząt, m.in. ograniczenie chorób przenoszonych drogą płciową (zaraza stadnicza) czy ułatwienie kojarzeń osobników utrzymywanych w odległych lokalizacjach. Obecnie sztuczne unasiennianie cieszy się dużym zainteresowaniem hodowców koni, gdyż oznacza łatwiejszy dostęp do materiału wybitnych reproduktorów, także nasienia mrożonego, i przyspieszenie postępu hodowlanego. Przechowywanie nasienia w ciekłym azocie pozwala na uzyskiwanie potomstwa po wyjątkowych ogierach także po ich śmierci.

Biotechniką o przełomowym znaczeniu dla rozwoju wspomaganego rozrodu ssaków jest kompleksowa procedura pozyskiwania zarodków w warunkach laboratoryjnych, powszechnie znana pod obiegową nazwą „zapłodnienie in vitro – IVF”. Procedura ta obejmuje pozyskiwanie niedojrzałych gamet żeńskich (oocytów), zwykle z jajników samic rzeźnych, poddanie ich dojrzewaniu in vitro (IVM), zapłodnieniu in vitro (IVF) oraz inkubacji in vitro uzyskanych zarodków (IVC). Szóstego – siódmego dnia po zapłodnieniu zarodki w stadium blastocysty można już bezkrwawo przenieść do macicy matki zastępczej, w której się zaimplantują i rozwiną w prawidłowy płód. Pomimo olbrzymiego zainteresowania i zaangażowania wielu naukowców i hodowców, efektywność standardowej procedury IVF u konia domowego jest bardzo daleka od zadawalającej. Dotychczas na świat przyszły dwa żywe źrebięta wywodzące się z zarodków pozyskanych z oocytów zapłodnionych wprawdzie in vitro, ale dojrzałych w jajniku klaczy, a więc in vivo. Obserwuje się różnorakie problemy np. z odzyskiwaniem oocytów z pęcherzyków jajnikowych, z dojrzewaniem oocytów w warunkach in vitro czy z uzdatnianiem (kapacytacją) plemników ogiera do zapłodnienia oocytu in vitro. Intensywne badania przyniosły jednak pewien efekt w postaci opracowania nowatorskiej metody chirurgicznego wprowadzania (mikroiniekcji) plemnika do oocytu pod kontrolą mikroskopu (intracytoplasmic sperm injection – ICSI). Mikroiniekcja plemnika do oocytu klaczy po raz pierwszy z sukcesem została zastosowana przez zespół prof. Squires ze Stanów Zjednoczonych w 1996 r. Zabieg przeprowadza się pod mikroskopem z wykorzystaniem mikromanipulatora. Co ciekawe, wprowadzony plemnik może nie wykazywać ruchu lub być pozbawiony witki. Wykorzystuje się także plemniki z oznaczonym fluorescencyjnie chromosomem płci, co jednoznacznie określa płeć potomka. Warto nadmienić, że technika ICSI jest bezpieczna i obecnie powszechnie stosowana we wspomaganym rozrodzie człowieka.

Pierwsza była Dolly

Zaawansowane manipulacje na oocytach i zarodkach ssaków znajdują się obecnie w centrum zainteresowania biologów na całym świecie. Główne nurty badań koncentrują się wokół transgenezy i klonowania. Przez wiele lat doświadczenia nad uzyskaniem klonu ssaka kończyły się niepowodzeniem. Dopiero urodzenie owcy Dolly w 1996 r. okazało się przełomowe dla badań nad klonowaniem zwierząt. W kolejnej dekadzie otworzył się przysłowiowy worek z klonami wielu gatunków zwierząt gospodarskich (np. bydło 1998, świnia 2000, koń 2003, pies 2005) i dzikich (np. gaur 2000, muflon 2001, wilk 2007). Obecnie wydaje się, że można sklonować dowolny gatunek ssaka. Jednakże, gdy w 1990 r. wykonywano pierwsze doświadczenia nad zapłodnieniem in vitro oocytów konia, trudno było przewidzieć takie możliwości. Czy zatem w obecnych czasach, przy dynamicznym rozwoju nauki, możemy sklonować swojego wyjątkowego konia? Odpowiedź jest jednoznacznie pozytywna, gdyż dotychczas udało się już uzyskać klony wielu osobników. Pierwszy klon koniowatych (muła) złożony z 3 źrebiąt pojawił się w 2003 r. Zwierzęta te powstały w wyniku połączenia komórki skóry dorosłego muła z oocytem klaczy. W tym samym roku, 28 maja, przyszedł na świat we Włoszech pierwszy klon konia domowego. Była to klaczka rasy haflinger o imieniu Prometea. Wywodziła się ona także z komórki skóry (fibroblastu) dorosłej klaczy. Bardzo ciekawym elementem tego doświadczenia było użycie dawczyni komórki skóry jako matki zastępczej uzyskanego klonu. Zatem urodziła ona źrebię będące jej własną kopią (klonem).

Od komórki do klona

Procedura klonowania ssaków metodą przenoszenia jąder komórek somatycznych (SCNT Somatic cell nuclear transfer) jest z pozoru prosta (schemat 1). Należy pobrać dowolną komórkę somatyczną dorosłego osobnika (np. fibroblasty skóry) i wprowadzić ją do gamety żeńskiej (oocytu), uprzednio pozbawionego własnego materiału genetycznego. Uzyskany w ten sposób konstrukt oocyt + komórka somatyczna należy poddać aktywacji, np. w polu elektrycznym, i umieścić w inkubatorze. Rozwijający się zarodek można przenieść po kilku dniach do macicy matki zastępczej. Będzie on klonem osobnika, od którego pobrano komórkę somatyczną (np. fibroblasty skóry). Ponieważ liczba komórek somatycznych w organizmie zwierzęcia jest olbrzymia, stąd teoretycznie liczebność uzyskanego klonu może być także duża. Jednak w tym miejscu musimy zakończyć rozważania teoretyczne i przedstawić bezlitosne fakty towarzyszące badaniom nad klonowaniem konia.

Kluczową rolę w klonowaniu odgrywa dostępność dużej liczby żeńskich komórek płciowych (oocytów), biorców komórek somatycznych oraz możliwość uzyskiwania zarodków in vitro. Źródłem oocytów są zwykle jajniki samic rzeźnych, chociaż istnieje także możliwość ich przyżyciowego pozyskiwania, co ma szczególne znaczenie w przypadku cennych zwierząt. Jajnik klaczy posiada średnio 5 pęcherzyków jajnikowych o średnicy ok. 5 mm. Pobieranie oocytów od żywych klaczy odbywa się na zasadach zbliżonych do klasycznego badania ultrasonograficznego, przy czym głowica urządzenia USG jest zmodyfikowana (igła i system ssący). Zabieg ten nosi nazwę OPU (Ovum pick-up) i polega na przekłuciu ściany pochwy i pobieraniu oocytów z jajnika. Podczas sesji OPU można odzyskać średnio 3-6 oocytów. Pozyskiwanie oocytów z jajników klaczy rzeźnych jest znacznie tańsze, i polega na nacinaniu jajnika skalpelem, a następnie łyżeczkowaniu i przepłukiwaniu poszczególnych pęcherzyków jajnikowych. Efektywność tej metody jest ograniczona do 3-4 oocytów z jajnika. Należy zaznaczyć, że bezpośrednio po pobraniu z jajników, oocyty nie nadają się do procedury klonowania i muszą przejść etap przygotowawczy, nazywany dojrzewaniem. Oceniono, że ok. 70% pozyskanych oocytów ma prawidłową morfologię i nadaje się do dojrzewania in vitro. Podczas 24 godzin inkubacji w warunkach in vitro prawidłowy rozwój wykazuje maksymalnie 60% oocytów klaczy. Efektywność klonowania konia domowego, podobnie zresztą jak bydła czy świni, jest bardzo niska. Do macicy klaczy wprowadza się do 4 klonowanych zarodków. Pierwsze badanie ultrasonograficzne w celu diagnozy ewentualnej ciąży wykonywane jest 17 dnia po owulacji. Obserwuje się niski współczynnik implantacji zarodków w macicy oraz wysoką częstość poronień na początku i w połowie ciąży. Jednakże w przeciwieństwie do bydła, poronienia na etapie zaawansowanej ciąży są znacznie rzadsze u klaczy. Prawdopodobnie ma to związek z różnymi typami łożyska występującymi u bydła i u klaczy. Można zatem założyć, że klonowane zarodki konia, które uległy implantacji w macicy i przeżyły połowę ciąży powinny rozwinąć się w dorodne, zdrowe źrebięta.

Szczególne osiągnięcia w klonowaniu konia ma zespół prof. Katherine Hinrichs z College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences (USA). W 2007 r. zespół ten opublikował podsumowanie wyników swoich dotychczasowych badań, w których do klonowania wykorzystano ponad 700 dojrzałych in vitro oocytów. W wyniku wprowadzenia komórek somatycznych i aktywacji oocytów uzyskano zaledwie 35 blastocyst (4,8%; 35/723). Do 26 matek zastępczych przeniesiono 26 blastocyst i potwierdzono 16 ciąż (62%). Niestety, 7 z nich zakończyło się poronieniem i w efekcie urodziło się tylko 9 klonów. Jak widać, efektywność procedury klonowania jest bardzo niska, gdyż urodzone źrebięta stanowiły zaledwie 1,2% oocytów poddanych rekonstrukcji (9/723) oraz 35% przeniesionych blastocyst (9/26). W chwili publikowania wyników 7 klonów było w wieku 10-14 miesięcy, podczas gdy 2 pozostałe padły krótko po urodzeniu.

Wysoka cena nie odstrasza hodowców

Trudno jednoznacznie oszacować koszty uzyskania klonu danego konia. Jednak biorąc pod uwagę niską efektywność procedury i wiążące się z nią wysokie nakłady finansowe (przygotowanie oocytów i komórek somatycznych, odczynniki, specjalistyczny sprzęt, ponadprzeciętna wiedza i umiejętności personelu, przygotowanie matek zastępczych itd.), cena klonu na pewno będzie bardzo wysoka. Jedynym pocieszeniem może być fakt, że efektem procedury może być klon złożony z kilku osobników. Jest to jednak nieprzewidywalne, gdyż z podobnym prawdopodobieństwem zabieg może się skończyć niepowodzeniem. Według VIAGEN – the cloning company z Teksasu, cena pierwszego komercyjnie sklonowanego konia wyniosła 150 tys. $, natomiast drugiej kopii tego samego konia 90 tys. $.

Pomimo niezadowalającej efektywności klonowania i wysokich nakładów finansowych, zainteresowanie hodowców uzyskiwaniem klonów wybitnych zwierząt jest olbrzymie. Dla hodowcy oznacza to „powrót do życia” wyjątkowego osobnika, a w szczególnych przypadkach stanowi jedyny sposób na wzbudzenie po nich „potomstwa”. Dotyczy to szczególnie osobników płci męskiej, które w standardowej procedurze hodowlanej zostały pozbawione gonad w młodym wieku. W chwili podejmowania decyzji o kastracji ogierek jest zwykle w wieku powyżej 15 miesięcy. Uważa się jednak, że najlepszym momentem na kastrację ogierów jest wiek 2-3 lat. W tym czasie hodowca nie posiada jeszcze żadnych informacji na temat potencjału sportowego zwierzęcia, a jedyną wiedzę może czerpać z historii jego rodziców. Jeżeli po wielu latach okaże się, że dany wałach miał wyjątkowy talent sportowy i zdobył wiele cennych nagród, lokując się w czołówce koni w danej dyscyplinie sportu, jest już za późno na wykorzystanie go w hodowli. W takiej sytuacji cenne umiejętności odchodzą wraz ze zwierzęciem. Dlatego możliwość uzyskania klonu wybitnego konia jest czasami jedynym sposobem na zachowanie wyjątkowej linii.

W drugiej części naszych rozważań, która ukaże się w kolejnym numerze „Koni i Rumaków”, przedstawimy historię słynnych klonów oraz omówimy problemy towarzyszące ich rozwojowi.

Shopping Cart
Przewiń do góry